尊龙凯时细胞冻存操作指南

细胞冻存是一种将细胞置于低温环境中，以降低细胞代谢活动，达到长期储存和保种目的的技术。这一过程能够为后续实验或临床应用提供细胞资源。一般来说，细胞冻存遵循慢冻原则，允许细胞逐步脱水，从而避免因冰晶形成而对细胞造成的损害。

一、冻存原理

当温度降至-70℃时，细胞内的代谢和酶活性几乎完全停止，而低于-130℃时，则可以实现最佳存活率。液氮是用于细胞长期保存的理想介质。冻存保护剂二甲基亚砜（DMSO）能迅速穿透细胞膜，降低冰点，延缓冻存过程，同时增加细胞膜的通透性，提高细胞内离子浓度，从而减少细胞内冰晶的形成，达到保护细胞的效果。

二、贴壁细胞冻存操作步骤

1. 预热冻存液；
2. 使用PBS冲洗细胞，加入胰酶进行消化（与细胞传代操作相同）；
3. 消化结束后重悬细胞，转移至无菌EP管，1000rpm离心5分钟；
4. 弃去上清，加入预热的细胞冻存液，细胞冻存的最佳密度为5×10⁶~1×10⁷/ml，通常不低于5×10⁵/ml；
5. 分装完毕后，拧紧冻存管盖并做好标记；
6. 将分装好的冻存管置入程序降温盒，放入-80℃冰箱过夜；
7. 最后，将冻存管移至液氮中进行长期保存。

三、悬浮细胞冻存操作步骤

1. 使用移液管均匀吹吸细胞悬液，并将其转移至离心管；
2. 以1000rpm速率离心3分钟，收集细胞沉淀；
3. 用预热的冻存液重悬细胞，最佳冻存密度为3-5×10⁶/ml，通常不低于5×10⁵/ml；
4. 完成分装后，拧紧冻存管盖并做好标记；
5. 将冻存管置入程序降温盒，放入-80℃冰箱过夜；
6. 最后，将冻存管转移至液氮进行长期保存。

注意事项

1. 细胞培养、传代及冻存过程中需严格遵循无菌操作。
2. 传代时消化需适度，消化时间取决于多种因素，注意监测细胞形态变化，一旦出现胞质回缩或连接变松，需要立即停止；
3. 应在细胞对数期且未达到汇合状态时进行传代。
4. 冻存液需提前配制，切勿直接将DMSO加入细胞悬液中。
5. 选择汇合度在80%-90%左右且活力超过90%的对数生长期细胞进行冻存，以确保最佳状态，冻存密度应根据细胞特性进行调整。
6. 程序冻存盒、细胞冻存液和培养基应在室温下复温后使用。
7. 冻存前切勿过长时间消化、过重吹打或过高离心，以免损伤细胞。
8. 冻存管的盖子务必拧紧，以防止复苏时水分渗入并造成污染。
9. 细胞不可长期存放于-80℃冰箱，存放时间勿超过3天。
10. 液氮或冰箱远离细胞房，需将细胞放置在干冰或冰盒中运输至细胞房。

对于生物医疗领域的专业人员来说，充分掌握尊龙凯时的细胞冻存技术，是确保细胞活力与应用成功的基础。引导科学研究与临床应用，更需精准操作与注意细节。